然而，迄今为止3D培养技术还局限在一些有限的实验室，没有被广大生物及医学科研工作者所掌握及使用。3D培养的操作方法能否像2D培养一样简单，成为生化实验室的常规方法？目前2D细胞培养已形成了从培养到后处理和表征的全套近乎标准的流程，这是2D培养如此流行的根本原因。
近日，EFL在Bio-Designand Manufacturing期刊发表了题为Facile 3D cell culture protocolbased on photocurable hydrogels的Technical Note，给出了一种基于光固化水凝胶的轻量化3D细胞培养方案，谢明君博士为第一作者，贺永教授为通讯作者。研究人员通过系列的工具包括多型号的光固化水凝胶，固化环，可控光源和水凝胶裂解液实现3D细胞培养的简单、量化及可控。
图1 轻量化的3D细胞培养流程
工作流程步骤一：Bioink制备
在实际的有机体中，不同的组织拥有具有特定成分和强度的基质，以实现一系列生物学功能。因此，就3D细胞培养而言，首先要考虑的因素是ECM的选择。用于体外3D培养的合适ECM具有三个主要要求：生物相容性水凝胶基底、合适的强度和其他必要的ECM成分。在这里，GelMA水凝胶因其出色的生物相容性和成型能力而被选作本文体外3D培养的ECM基础。根据体内的实际组织选择具有适当取代度和其他必要成分的GelMA水凝胶。例如，如果研究人员想在3D环境中培养肝细胞，则需要选择合适的GelMA类型，使其固化后可达到6-8kPa的拉伸模量。另外，需要将肝脏组织的无细胞基质添加到GelMA前驱液中。就软骨细胞而言，研究人员需要添加足够的透明质酸以实现其相关的生物学功能。选择了GelMA和其他成分后，通过将冻干的GelMA溶解在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中，制备合适的浓度，该溶液包含光引发剂（LAP）和选择的添加物。从培养瓶中分离细胞，并用制备的溶液重悬以形成生物墨水。
第二步：在3D环境中培养
在培养过程中，一方面，3D细胞培养需要全方位的物质交换空间，因此样品必须漂浮在培养基中，而不是简单地沉入培养皿底部。另一方面，尽管交联的GelMA水凝胶具有较高的生物相容性，但其机械强度较低，特别是具有较低取代度的墨水。这些3D样本总是太软，以致于无法在培养过程中保持初始形状并无法在随后的表征中进行操作。因此，考虑到这些难题，我们发明了固化环。将制备好的生物墨水浇筑到固化环上并用可定时的蓝光光源使其交联。固化环上的把手或支撑脚可以方便在操作时抓取样品，并为物质交换形成更大的空间，更密的固化环网格可以保持较低模量的交联GelMA的形状。
第三步：细胞回收
培养一段时间后，可以对样品进行后处理以进行细胞表征和分析。处理后的3D样本中存在两种情况。一方面，某些样品中的水凝胶无需降解，可以对细胞进行简单处理，例如对细胞产物进行染色，可以在光学显微镜或共聚焦荧光显微镜下直接观察染色的样品。另外，在某些生物学测试项目中，例如流式细胞仪（FCM），聚合酶链反应（PCR），酶联免疫吸附测定（ELISA）等，必须使用水凝胶分离3D样品中的细胞。因此，我们设计了GelMA裂解液，使固化的GelMA降解而不会损坏细胞，回收的细胞可用于这些表征当中。
第四步：生物学表征
通过回收的细胞，研究人员可以进行一系列生物学测试项目，例如显微镜观察，FCM，ELISA，PCR等。根据这些测试和分析结果，研究人员可以得出3D细胞体外培养数据，并可进一步估计不同刺激因素在相关生物医学应用中的作用。
为了检查提出的3D细胞培养方案的可行性，我们以这种3D培养方式培养了不同种类的细胞，包括人脐静脉内皮细胞（HUVEC），大鼠脂肪来源干细胞（rat-ADSC），人骨间充质干细胞（hBMSC）并测试了它们的存活率，伸展能力和分化。用5％（w/v）EFL-GM-60和0.5％（w/v）LAP制备GelMA前驱液。将HUVECss，大鼠ADSC和hBMSC分别混入其中并在EFL-SCR-2D-24-2固化环上固化。在完全培养基中培养HUVEC和大鼠ADSC，在成骨诱导培养基中培养hBMSC。观察发现，包裹的大鼠ADSC和hBMSC在培养的第一天和第七天都显示出高存活率。从固化环的光镜图像中，我们可以发现细胞均匀地分布在交联的GelMA内部的3D空间中。此外，包裹的细胞在培养7天后会在3D环境中扩散。该结果表明，在提出的3D培养方案中，包裹在3D固化环上的GelMA中的细胞可以保持较高的存活率和伸展能力。
此外，研究人员测试了hBMSC的成骨分化和HUVEC的血管分化。与培养14天后的空白组相比，诱导的hBMSC显示出高碱性磷酸酶（ALP）表达，茜素红S（ARS）染色的钙结节也表明，包裹的hBMSCs实现了成骨分化。此外，包裹的HUVEC在细胞膜上显示了血小板内皮细胞粘附分子-1（CD31）的高表达，并显示了明显的细胞增殖。
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